摘要：菌落總數作為判定化妝品被污染的程度標志，關系到產品的衛生質量及使用的安全性，本文針對膏狀浴鹽菌落總數的測定進行詳述，并對今后化妝品菌落總數的檢測方法及方向進行探討和展望。
關鍵詞：膏狀浴鹽 菌落總數 測定 方法探討
微生物的世界變化莫測、令人著迷，它無處不在，存在于我們生活的每一個角落，存在于產品生產的每一道工序中。由于膏狀浴鹽在生產過程中是先制成膠體、加鹽后再制成膏體的，膠體系統有時會受到微生物的污染和降解，膏體系統偶爾也會有耐鹽菌存活，污染源包括原材料、制作過程、設備和操作人員等；產品包裝的設計在膏狀浴鹽微生物污染中舉足輕重，其中廣口容器最易受到污染；膏狀浴鹽的水分較粉狀浴鹽多，更易支持微生物的生長……由于浴鹽成品本身是不再滅菌的，并且其生產原料通常也是不滅菌的，只是在生產中通過溶解原料時加溫和半成品存放中照射紫外線來殺菌，因此，我們不可能100%地清除浴鹽生產原料、設備、環境和操作過程中的微生物。只能通過質控和檢測來減少微生物進入到產品中，將其控制在一個對生產和對消費者相對安全的水平。
一、檢測目的
微生物是影響化妝品衛生安全的重要指標，也是產品衛生質量合格與否的重要標志。根據權威檢驗部門的結論及多年來化妝品檢測的數據分析：化妝品微生物檢測指標中合格率較低的項目主要是菌落總數，其次為霉菌和糞大腸菌群，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌只是在個別化妝品中才會檢出。絕大多數化妝品微生物不合格的原因是菌落總數超標，而較少或根本檢測不出腸道細菌、真菌或致病菌。由此可見，影響化妝品質量的主要微生物指標是菌落總數，但同時它與其它菌之間存在著一定的關聯。化妝品中菌落總數越多，糞大腸菌群、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的檢出率也越高；反之，如果在某一樣品中檢出金黃色葡萄球菌、糞大腸菌群和銅綠假單胞菌，那么該樣品的菌落總數肯定會超過國標的相關規定。
隨著人們對化妝品要求的不斷提高，化妝品廠家在生產中增添了多種動植物原料和營養成份，為細菌的生長繁殖創造了良好的條件。雖然沐浴鹽的主要成分是鹽，鹽具有殺菌消炎的功效，但在膏狀浴鹽配方設計過程中考慮到鹽顆粒在膠體中懸浮的均勻性以及使用時泡沫是否豐富等因素會將鹽含量限制在一個合適的范圍中。只是沐浴鹽與其它沐浴液相比，微生物生長的機會非常小甚至沒有，但不能保證產品一定是無菌的，需要通過成品微生物檢測來判定。為及時掌握膏狀浴鹽在生產過程中的衛生質量與衛生安全，了解和核查生產中所選用原料、生產設備、工藝流程及操作人員的衛生狀況，判定產品在生產過程中被微生物——細菌污染的程度，我們建議采用標準平板計數法與TTC瓊脂培養基法相結合來進行菌落總數的測定，以此作為改進生產工藝及判定成品衛生質量是否合格的依據。
二、菌落總數的定義及檢測原理
菌落的英文是（colony），定義為細菌和其它幾種微生物在固體培養基上生長繁殖而形成的能被肉眼識別的生長物，它是由數以萬計的相同細菌聚集而成的，故又有細菌集落之稱。各種細菌的菌落各自具有一定的特征，按其特征的不同可以在某種程度上鑒別某種細菌，為微生物檢驗提供依據。菌落總數系指檢樣經過外包裝清潔消毒，樣品稱量、稀釋等處理，在一定條件下培養后（如培養基成分、培養溫度、培養時間、pH 值、需氧性質等），分裂生長成一個個肉眼或低倍顯微鏡下可見的細菌集落，并通過平皿計數，1g（或1ml）檢樣中所含菌落的總數。其培養的原理是指檢樣在被稀釋到一定濃度后，吸取一定量的檢樣，檢樣中的細菌細胞和培養基均勻混合后，每個細菌細胞都形成一個肉眼可見的菌落的假設為基礎的。由于各種化妝品中被污染的細菌種類不同，如浴鹽中會存在由海水或井下鹵水帶來的極少量的嗜鹽菌、表面活性劑原料中偶爾夾帶的枯草芽孢桿菌等，每種細菌都有它一定的生理活性，培養時對培養要求，如溫度、時間等有所不同，而在實際檢驗工作中，不可能滿足所有菌的培養條件，因此所測定的結果只包括在本方法規定的條件下（在卵磷脂、吐溫80營養瓊脂上，于37℃培養48小時）生長的一群嗜中溫的需氧性菌落總數。厭氧或微需氧菌、有特殊營養要求的以及非嗜中溫的細菌，在該條件下難以繁殖生長。即實際存在的菌落數大于檢測出來的菌落總數。菌落總數并不能區分其中細菌的種類，有時也被稱為雜菌數、需氧菌數等。
三、檢測方法
菌落總數的測定是將被檢樣品制成幾個不同的10倍遞增稀釋液，然后從每個稀釋液中分別取出1ml置于滅菌平皿中與TTC—卵磷脂吐溫80營養瓊脂培養基混合，在一定溫度下，培養一定時間后（一般為48小時），記錄每個平皿中形成的菌落數量，并依據稀釋倍數，計算出每克（或每ml）原始樣品中所含有的細菌菌落總數。檢驗方法參見2007年版《化妝品衛生規范》。由于規范中的檢測方法是針對所有化妝品的，故本文在規范方法的基礎上，結合膏狀浴鹽的產品特性及檢測的實踐經驗，對其菌落總數的測定進行了補充和注解，以供鹽行業內浴鹽微生物檢測人員交流參考。
基本操作一般包括：樣品采集和制備－－稀釋－－傾注平皿－－培養48小時－－計數報告。
（一）儀器和試劑
1.儀器
250ml三角瓶、200ml量筒、15×150mm試管、直徑 9cm滅菌平皿、10ml、2ml和1ml滅菌刻度吸管、酒精燈、放大鏡、pH 計或精密 pH 試紙、高壓滅菌器、36℃±1℃恒溫培養箱。
2.試劑
（1）滅菌蒸餾水
成分： 蒸餾水 1000mL
制法：將蒸餾水分裝到加玻璃珠的三角瓶內，每瓶 90ml，103kPa（121℃ 15 lb）下高壓滅菌20min。
（2）卵磷脂吐溫80—營養瓊脂培養基
成分：蛋白胨 20.0g
牛肉浸出粉或膏 3.0g
氯化鈉 5.0g
瓊脂 15.0g
卵磷脂 1.0g
吐溫80 7.0g
目前該培養基市上有售，不需要自行配制，購買時應選擇技術力量強、通過質管體系認證的企業產品，培養基品牌要相對固定，不要經常更換廠家，以避免試驗中因使用不同廠商的產品所造成的誤差，影響檢驗結果的準確性。由于培養基的原材料不同，品牌生產商使用的原料蛋白胨質量較好、顏色偏淺，制出的培養基透明度高，菌落易分辨，個別廠商生產的培養基雜質較多，菌落與雜質較難分辨。建議到杭州華東醫藥股份有限公司或杭州微生物試劑有限公司等正規渠道購買。
使用方法：取本品51g于1000ml蒸餾水中，加熱、攪拌至溶解，經121℃、20min滅菌后，冷卻至45—50℃時，傾注平皿備用（具體參照培養基上的使用說明）
0.5％氯化三苯四氮唑（2,3,5-triphenyl terazolium chloride，TTC）
成分： TTC 0.5g
蒸餾水 100ml
制法：溶解后過濾，103.43kPa（121℃ 15 lb）20min 高壓滅菌，裝于棕色試劑瓶內，置4℃中冰箱備用。
（二）樣品的采集及制備
1.供檢樣品的采集
（1）所采集的樣品，應具有代表性，一般視每批浴鹽數量的大小，根據產品標準中的檢驗規則抽取相應數量的包裝單位。由于膏狀浴鹽呈膏體粘稠形態，灌裝前成品取樣時不應集中一點，宜多采幾個部位。
（2）待檢的浴鹽，應嚴格保持原有的包裝狀態，軟管、塑料罐等包裝不應有破損，檢驗前不得打開，防止樣品被污染。若包裝表面有污染，檢驗前應用酒精棉花擦拭干凈。
（3）接到樣品后，應立即登記，編寫檢驗序號，并按檢驗要求盡快檢驗。如不能及時檢驗，樣品應存放在室溫陰涼、干燥處，不需冷藏或冷凍。
（4）特殊情況下，若只有一個樣品而同時需做多種檢驗，如細菌、重金屬、理化等，則應先取出部分樣品做細菌檢驗，再將剩余樣品做其它分析。
（5）操作中必須有“無菌操作”的概念，所用玻璃器皿必須是完全滅菌的，不得殘留有細菌或抑菌物質。所用剪刀、鑷子等器具也必須進行消毒處理。如果是出廠檢驗，應用75%酒精在包裝開口處擦拭后取樣。全部操作應在超凈工作臺或經過滅菌處理的無菌室內進行。
2.供檢樣品的制備
稱取10g樣品，加到裝有玻璃珠和90ml蒸餾水并已滅菌的錐形瓶中，充分振蕩混勻（如有均質器，均質1~2min效果更好），靜置15min。取其上清液作為1:10的檢液。若樣品過于粘稠，可稱取25g樣品加到裝有225ml蒸餾水和玻璃珠并已滅菌的錐形瓶中，以加大樣品量來提高檢樣的代表性。
3.樣品的稀釋
（1）稀釋液：樣品稀釋液一般是滅菌生理鹽水，但對含鹽量較高的膏狀浴鹽進行稀釋時，可采用滅菌蒸餾水，以防檢樣稀釋液氯化鈉濃度過高抑制了細菌的生長。在每支15×150mm試管中吸入9ml蒸餾水，制作數量根據樣品的多少及稀釋倍數而定，滅菌待用。
（2）用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌蒸餾水的試管內，振搖試管混合均勻，制成1：100的稀釋液，注意吸管進出三角瓶或試管時，吸管口不觸及瓶口、管口的外圍部分。另取1ml滅菌吸管，按上述操作順序，制成10倍遞增稀釋液，以此類推。平行樣重復此操作。
（3）為減少樣品的稀釋誤差，在進行連續遞增稀釋時，每一稀釋液應充分振搖，使其均勻，同時每一稀釋度應更換一支吸管，應將吸管內液體沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀釋液內，以免吸管外部粘附的檢液溶于其內。
4.傾注培養
（1）根據樣品被污染的情況估計，選擇2—3個適宜的稀釋度，每個稀釋度做兩個平皿（平行樣），吸取1ml選定稀釋度的稀釋液于滅菌平皿中。由于膏狀浴鹽含鹽量較高，從以往的經驗檢測數據來看，選擇1/10和1/100的稀釋度比較合適，但如果在浴鹽中添加了較多的天然植物或中草藥成分的話，選擇1/100和1/1000的稀釋度比較適宜。
（2）待檢用的培養基應在45-50℃水浴內保溫，傾注時培養基溫度過高會燙死部分不耐高溫的細菌，使菌落總數檢測結果偏低；過低瓊脂易凝固結塊而不能與檢液充分混勻，且培養后的平皿不易計數。如無水浴，應以皮膚感受較熱而不燙為宜。
（3）將融化并冷卻至45-50℃的卵磷脂吐溫80營養瓊脂培養基傾注到平皿內，傾注量在12ml—20ml之間，以每皿約15ml為宜，培養基過厚會影響觀察計數，太薄又易于干裂。傾注時，培養基底部若有沉淀物，應將底部棄去，避免過多的雜質與菌落混淆而影響計數觀察。
（4）為使菌落能在平板上均勻分布，檢液加入平皿后，應盡快傾注培養基并輕輕地水平晃動平皿，使樣品與培養基充分混合均勻。檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用時間不宜太長，一般不超過20min，以防止細菌有所死亡或繁殖。
（5）分別將營養瓊脂培養基傾入加有1ml稀釋液（滅菌蒸餾水）的滅菌平皿內作稀釋液空白對照、傾入不加樣品的滅菌空平皿內作培養基空白對照、傾入敞開放置于無菌室操作臺上的滅菌空平皿作空氣空白對照。培養基空白對照可以避免培基中的雜質與細菌菌落發生混淆、不易分辨的情況，以便計數時作對照觀察。空氣（環境）空白對照可以每年檢驗2—3次，采用操作臺面上對角線五點檢測，而稀釋液和培養基空白對照最好每次都做。
（6）待瓊脂凝固后，翻轉平皿，置 36℃±1℃培養箱內培養 48h±2h，取出計算平板內菌落數目，乘以稀釋倍數，即得每克（每毫升）樣品所含菌落總數。
（7）培養時間規范上要求48h±2h，根據多次觀察，由于膏狀浴鹽含有一定量的鹽分，檢出的菌落總數較少，一般1/10只有個位數，1/100幾乎沒有。在生產銷售緊急的情況下，通過24h的培養也可以計數，只是培養48h后，菌落個頭變得更大更明顯而已，此時計數不易發生差錯，但在正常情況下應按規范上要求的時間培養。
（8）為便于區別浴鹽中的顆粒與菌落，可在每100ml卵磷脂吐溫80營養瓊脂中加入1ml0.5%的TTC溶液，如有細菌存在，培養后菌落呈紅色，而浴鹽的顆粒顏色則無變化。
（9）培養箱應保持一定的濕度，瓊脂平板培養48h后，培養基失重不應超過15％。
5.計數報告
培養到時間后，點數菌落數。先用肉眼觀察，必要時用放大5～10倍的放大鏡檢查，以防遺漏。記下各平皿的菌落數后，求出同一稀釋度各平皿生長的平均菌落數，計算出原始樣品中每克（或每ml）中的菌落數，進行報告。
（1）到達規定的培養時間后，應立即計數。如果不能立即計數，應將平板放置于0－4℃環境中，但不得超過24h。
（2）計數時應選取菌落數在30～300之間的平皿，作為菌落總數計數的依據。 若有二個稀釋度均在30～300之間時，則按規范要求以二者之比值決定，若比值小于或等于2則取平均數，比值大于2則報告其中稀釋度較低的平皿的菌落數報告之。
（3）若所有稀釋度的平均菌落數均不在計數區間，如均大于300個，則應按稀釋度最高的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之；如均小于30個，則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。如菌落數有的大于300個，而有的又小于30個，均不在30～300個之間，則以最接近300或30的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。若所有的稀釋度均無菌落生長，則應按每g或每ml小于10CFU報告之。
（4）不同稀釋度的菌落數應與稀釋倍數成反比（同一稀釋度的二個平板的菌落數應基本接近），即稀釋倍數愈高菌落數愈少，稀釋倍數愈低菌落數愈多。如出現逆反現象，則應視為檢驗中的差錯（膏狀浴鹽有時會出現逆反現象），不應作為檢樣計數報告的依據。若空白對照平板出現菌落，則此次檢測結果無效。
（5）當平皿上有鏈狀菌落生長時，如呈鏈狀生長的菌落之間無任何明顯界限，則應作為一個菌落計，如存在幾條不同來源的鏈，則每條鏈應按一個菌落計算，不應把鏈上生長的每一個菌落分開計數。如有連成片狀的菌落或花點樣菌落蔓延生長時，該平皿不宜計數。若片狀菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落數分布又很均勻，則可將此半個平皿菌落計數后乘以2，以代表全皿菌落數。
（6）當計數平板內的菌落數過多（即所有稀釋度均大于300時），但分布又很均勻，則可取平板的一半或1/4計數，再乘以相應稀釋倍數作為該平板的菌落數。
（7）菌落計數的報告，菌落數在 10 以內時，按實有數值報告之，大于100時，采用二位有效數字，在二位有效數字后面的數值，應以四舍五入法計算。為了縮短數字后面零的個數，可用10的指數來表示。在報告菌落數為“不可計”時，應注明樣品的稀釋度。
（8）菌落的形成單位CFU，CFU是cotong forming units的英文縮寫，意思是菌落形成單位數，鑒于化妝品檢樣的細菌細胞是以單個、成雙、鏈狀、葡萄狀、成片花點樣或成堆的形式存在，因而在營養瓊脂出現的菌落可以來源一個細胞群，也可以是一個單個細胞，因此平板計數不報告準確的活菌個數，而是以單位重量、體積或表面積內形成單位數(CFU)報告，CFU／g(m1)表示每克或每毫升樣品中含有多少個菌落形成單位。
四、檢驗方法探討
目前我國對化妝品規定一律按《化妝品衛生規范》（2007年版）進行檢驗，它較以前的《化妝品衛生規范》（2002年版）和《GB 7918.2化妝品微生物標準檢驗方法》（1987年版）有明顯的改進。它的實施，對于進一步規范化妝品原料、生產、檢驗和包裝具有非常重要的指導意義，但是由于《化妝品衛生規范》適用于所有的化妝品，其中有一些細節問題還需要補充和完善，探討如下：
（一）菌落總數空白對照的改進
《化妝品衛生規范》中5.2要求的空白對照主要為培養基空白對照，該空白對照上如果沒有菌落生長,說明檢測過程所用的培養基、培養皿等用具的滅菌情況和檢驗的操作過程符合無菌要求；但如果有2個以上菌落生長，則需追加空白對照平皿進行培養觀察，以鑒別和判定到底是培養基還是培養皿、吸管等器具可能存在的污染，如有可能則在消除污染之后重新檢測。為減少誤差，建議在檢測過程中：1）將培養基空白對照由1個增至2個，使空白對照的數量與檢樣每個稀釋度測定的平皿數量( 均為2 個平皿)一致,這樣可以更好地反映無樣品時的細菌數量、反映器具和培養基的滅菌情況以及無菌操作情況；2）每次檢測樣品時增加稀釋液的平行空白對照，從而判斷稀釋液和試管的的滅菌情況；3）根據無菌室的滅菌情況，每年進行數次環境檢測，利于發現環境（空氣）和檢驗環節中存在的問題，進而更加準確地測定樣品的菌落總數。
（二）中和檢液的pH值
由于化妝品在生產過程中使用的一些原材料呈酸或堿性，所以最終產品可能偏酸或堿性。雖然多數生產廠家在成品前會將產品的pH值調至中性，但也有一些企業在產品中增添了一些功能性特殊原料，而這些原材料的功效必須在酸或堿性的環境中才能顯現出來，因此，建議做菌落總數時，先測一下原液或稀釋后檢液的pH值，若原液很粘稠，無法直接測定pH值，可用1/10檢液測定，發現其偏酸或堿時，在原液或稀釋后的檢液植入平皿前將其調成中性，調中性的酸堿一般使用弱酸或弱堿，如冰醋酸或純堿的稀釋液等，否則在太酸或堿的培養環境下細菌是無法生長的，這樣做會利于企業出廠檢驗的控制。盡管一些酵母和霉菌可耐受酸性環境（pH<4），但一般細菌生長的pH值是在中性范圍中，許多化妝品中的細菌都受到其不利pH值的抑制，如pH<4或pH>10。但隨著pH值逐漸遠離中性，細菌在其中的生長能力也逐漸減弱，在具有極端pH值的酸或堿環境中，很難發現有細菌生長。
（三）減少稀釋引起的誤差
在檢驗中，由于化妝品中含有防腐劑、消毒劑及某些修復成分等，抑制了細菌的生長, 會造成不同稀釋度檢出的菌落總數異常現象，而稀釋后，滅菌生理鹽水或滅菌蒸餾水等稀釋液緩解了防腐劑、消毒劑的作用，細菌的生存環境有了一定的改善, 使細菌開始生長繁殖，出現了樣品在第一稀釋度無菌生長，而第二或第三稀釋度有細菌生長（即稀釋度高的菌落數反而比稀釋度低的多）的情況。出現這種現象主要是防腐劑等化學物質，抑制了樣品中細菌的生長。在稀釋度高時，防腐劑的濃度低；稀釋度低時，防腐劑濃度高，從而造成菌落總數的逆反現象，針對這種情況：1.可使用抗干擾微生物培養基，其可分為抗防腐劑型、抗消毒劑型和抗臭氧型等。但抗干擾微生物培養基的價格通常比普通培養基貴，且要有針對性地使用，否則會無效，并造成另外的干擾。2.視樣品不同，不能一概使用滅菌生理鹽水或滅菌蒸餾水作稀釋液, 應在稀釋液配制中加入適量的能中和防腐劑或抑菌劑的物質，以減少稀釋帶來的誤差。
（四）提高細菌總數的檢出率
細菌種類繁多，每種細菌都有它一定的生理特性和培養要求，而在實際檢測過程中，我們不可能做到滿足所有菌的要求，只包括在一定的條件下（在卵磷脂、吐溫80營養瓊脂上，于37℃培養48小時）生長的一群嗜中溫的需氧及兼性厭氧的細菌菌落總數。而實際上在所檢樣品中可能不止存在這些細菌。當我們在做試驗研究或想檢出更多的菌種時，我們就要配制一種營養成分更全面、更豐富而又極易被大多數微生物吸收利用的培養基。研究資料顯示，使用美國食品藥品管理局(FDA)的標準平板培養基(即每1000 ml培養基含胰蛋白胨5g、酵母膏2.5g、葡萄糖1g、瓊脂 15g)測定細菌總數，比我們現在國內使用的卵磷脂吐溫80營養瓊脂（即每1000ml培養基含蛋白胨10g、牛肉膏3g、Nacl5g、瓊脂15g）平均檢出率高23.9%；另一種方法就是對卵磷脂吐溫80營養瓊脂培養基進行改進，在原來成分的基礎上分別添加0.1%葡萄糖和0.1%酵母膏，原因是該培養基沒有提供初始純碳源。培養基中的碳源、氮源均來自牛肉膏和蛋白胨，而葡萄糖是一種絕大多數細菌最易吸收利用的良好碳源，添加0.1%葡萄糖作為碳源對絕大多數細菌的初始生長是極為有利的。酵母膏營養豐富，除提供大量B族維生素、蛋白質、氨基酸、核酸等碳源、氮源外，還提供礦物質以及谷胱甘肽、酶類、核酸等具有生理活性作用的營養成分，添加0.1%的酵母膏利于絕大多數微生物的生長。
（五）測定方法展望
隨著微生物學和檢測技術的發展，產生了許多關于菌落總數測定的新技術和新方法，目前化妝品菌落總數測定的標準方法是平板計數法，其優點是能較好地反映菌落的疏密程度，重復性和平行性較好，可獲得活菌菌落信息，是經典的計數方法，缺點是培養時間長，需要配制培養基和清洗、消毒培養器皿等大量輔助性工作，操作過程繁瑣。相對于食品的直接入口而言，化妝品涂抹、噴灑于人體表面的特性，危害性要略小一些，但在生產任務緊急的情況下，產品需要當天出貨，采用規范的檢測方法48小時獲得的檢測結果實際意義有限。由此，快速檢測技術應運而生，并由培養水平向分子水平邁進。目前主要應用于食品但也有部分應用在化妝品領域內的快速檢測技術有：1.生物電化學方法：常見的有阻抗分析法、伏安分析法、電位電流分析法等；2.ATP生物發光法；3.濾膜法；4.量熱法；5.流式細胞術；6.顯微圖像識別技術；7.固相細胞計數法；8.機器視覺法等。菌落總數是目前國內最常用的微生物檢測項目，能否在最短的時間內快捷、準確地反映樣品的微生物數量，是我們微生物檢測人員今后努力的工作方向，特別是近年來隨著分子生物學、微電子技術及生物技術的發展，微生物快速檢驗技術已有了很大的突破，今后我們的方法標準一定會更加便捷、準確、合理、全面！
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